1.引言

人β-珠蛋白基因簇位于第11 号染色体上,由ε、Gγ、Aγ、δ 和β 五个功能基因按照发育阶段顺序依次排列组成,基因的表达限制在红细胞链系内并且由发育程序精确控制。在人的正常个体发育过程中,红细胞中珠蛋白的表达存在着明显的发育阶段特异性,存在着胚胎型(ε)到胎儿型(γ)、胎儿型(γ)到成人型(β)两个开关过程。

镰刀形细胞贫血症(SCD)及重型β-地中海贫血是两种最为常见的单基因遗传病,在包括中国在内的世界范围有着很高的发病率。该病是由于β-珠蛋白基因缺失或突变使蛋白合成受阻或结构异常而引起的慢性溶血性贫血。已有证据表明,如果在成人期已经关闭的γ-珠蛋白基因能够重新活化,表达的γ-珠蛋白能够代偿β-地中海贫血患者中β-珠蛋白的不足,贫血症状会明显改善。目前用药物活化成人γ-珠蛋白基因表达的方法已被广泛研究,但仅对部分病例有效,而且有较多负作用,长期治疗效果差[。因此寻找内在的γ-珠蛋白基因活化因子并运用于临床成为研究热点。如果γ-珠蛋白基因特异活化子能被确定,则可能为发展通过转移γ-珠蛋白活化因子基因重新活化成人红细胞中γ-珠蛋白基因的转录,治疗镰刀形细胞贫血症和重型β-地中海贫血症的新方法奠定基础。

人β-珠蛋白基因作为最早克隆的基因之一,人们对于β-珠蛋白基因簇的珠蛋白基因的启动子、增强子及位于基因簇上游的位点控制区(LCR)等顺式调控元件已经研究得相对清楚。关于β-珠蛋白基因在胎儿期被竞争性关闭,而 γ-珠蛋白基因则在成人期自主沉默的机制也已被广泛接受。特异活化 β-珠蛋白基因的重要反式作用因子如EKLF 也已经确认,并有进一步实验表明其存在转录后修饰和从胞质到胞核的定位转移是其参与激活 β-珠蛋白的关键。关于特异活化 γ-珠蛋白基因的转录活化因子,陆续报告了NF-E4、FKLF、FKLF2、NF-Y、SAR等潜在的活化子,研究结果显示其过量表达可显著提高红细胞中γ-珠蛋白基因的转录水平,但对于其在正常个体发育过程中对 γ-珠蛋白基因的活化作用以及作用的特异性仍不能确定。也有很多参与成人红细胞中γ-珠蛋白沉默的因子被确定,如DRED复合物,研究证明其可与 ε-及 γ-珠蛋白启动子区结合,参与 ε-及 γ-珠蛋白在成人期的沉默。NF-E4的异构体可通过使转录激活因子CP2与γ-珠蛋白启动子区的脱离参与γ-珠蛋白成人期沉默。另一方面,人们发现各珠蛋白启动子区的甲基化水平和组蛋白乙酰化水平均存在明显的发育阶段特异性,说明表观遗传学修饰在珠蛋白开关中也具有重要作用。尽管多年来的研究取得了很大进展,但由于珠蛋白基因转录调控规律远比人们所认识的复杂,至今尚未能完全阐明其调控机制。

遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合症(HPFH)是一种在成人阶段胎儿血红蛋白(HbF)持续高表达的遗传病,通常是由于β-珠蛋白基因簇内序列的缺失或γ-珠蛋白基因启动子突变所引起,而本组此前鉴定到一个HPFH 家系,其中两个成员均为HPFH 患者,通过Southern杂交及DNA 序列分析均未发现上述改变。据此推测,此家系成员HbF 与F 细胞水平升高很可能涉及到γ-珠蛋白基因转录相关因子的变化。而人脐带血中主要是胎儿血红蛋白的高表达,其中也很可能存在γ-珠蛋白基因活化因子的高表达,因此我们通过差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)方法比较了此家系成员的骨髓同正常成人骨髓红细胞及人脐带血来源的红细胞间的基因表达情况,鉴别得到了大量在人脐带血或HPFH 患者骨髓中表达高于正常成人骨髓的基因。

K562 细胞是一种白血病细胞系,能够在hemin 的诱导下向红系分化,主要表达β-珠蛋白基因簇中的ε-、γ-珠蛋白,基本检测不到β-珠蛋白的表达,可以作为研究ε-、γ-珠蛋白调节机制的很好细胞模型。而小鼠的红白血病细胞系MEL585 则主要表达β-珠蛋白基因,且可向诱导向红系分化。

在这里,我们着重研究了在脐带血红细胞内表达水平较高的ZF 基因和在HPFH 成员的骨髓红细胞中表达较高的SH3GLB1 基因的差异表达情况,以及其在细胞内的定位情况,并在人红白血病细胞系K562 细胞以及小鼠红白血病细胞系MEL585 中初步研究了其对于珠蛋白的调节作用。初步确定了ZF 对于人γ-珠蛋白启动子的活化作用和对于小鼠β-珠蛋白基因转录的抑制作用,以及SH3GLB1 对于小鼠β-珠蛋白基因转录的促进作用。

2.材料及方法

2.1 细胞培养

2.1.1 造血干细胞的体外诱导培养

2.1.1.1 CD34+造血干细胞的分离和纯化

把采集的新鲜脐带血或骨髓标本以含2mM EDTA的1×PBS稀释,用滴管反复吹打混匀。

在灭菌试管底部加入淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml),将稀释好的脐带血或骨髓样品用滴管轻轻铺于分离液上,20°C,400g水平离心30~40min。小心地吸取中间相(含淋巴细胞和单个核细胞)到一个新的50ml离心管中,再以含 2 mM EDTA的1×PBS 重悬细胞,反复洗两遍。随后利用磁珠分选的方法进一步分离CD34+造血干细胞(MACS磁珠试剂盒为Miltenyi Biotec公司产品)。首先将细胞重悬于所提供的缓冲液里,加FcR阻断剂到上清中,抑制非特异的抗体结合。随后加入CD34多重分选微磁珠,充分混匀,在冰箱6~12°C孵育30min。缓冲液洗细胞两次后,将MS柱放在MACS磁铁上,让阴性细胞通过,再将柱子放在一个合适的收集管上,收集阳性部分。

2.1.1.2 CD34+造血干/祖细胞体外诱导红系分化

分离得到的CD34+细胞,按照1×105cells/ml 的密度将细胞接种于5mm 培养皿中,1×IMDM,30%进口胎牛血清(FCS),1%牛血清白蛋白(BSA),100 μM β 巯基乙醇(β-ME),2ng/ml 重组人白介素3 (rhIL-3),100ng/ml 重组人干细胞因子(rhSCF),2U/ml 重组人促红细胞生成素(rhEpo)。(细胞因子均购自R&D 公司)37°C,5%CO2 细胞孵箱中培养,观察细胞生长情况,适时换液1~2 次。

2.1.2 细胞系的培养以及诱导分化

K562 细胞以及MEL585 细胞均培养于DMEM 培养基中,10% 胎牛血清(FCS),培养条件均为37°C,5%CO2。MEL585 于诱导前一天更换新鲜的完全培养基,使其在诱导当天处于对数生长期。于第二天向处于对数生长期的MEL585 入2%DMSO 诱导向红系分化。

NIH3T3 细胞培养于RPMI1640 培养基中,10% 胎牛血清(FCS),培养条件均为37°C,5%CO2。

2.2 真核表达载体的构建

2.2.1 EGFP 融合蛋白表达载体ZF-EGFPN1,SH3GLB1-EGFPN1 的构建

分别从脐带血以及HPFH 患者骨髓红系培养物cDNA 模板中以特异引物进行PCR 扩增得到ZF、SH3GLB1 全长DNA 片段,并在5及3引物中引入携带KpnI 和EcoRI 酶切位点,对PCR 产物进行纯化。将pEGFPN1 质粒和纯化的PCR 产物进行KpnI 和EcoRI 双酶切,切胶回收相应DNA 片段,并进行连接,转化,PCR 法挑取阳性克隆,并进行测序。

2.2.2 过表达载体ZF-pcDNA3.1+,SH3GLB1-pcDNA3.1+的构建

同上获得ZF、SH3GLB1 全长DNA 片段,并在5及3引物中引入携带XbaI 和BamHI酶切位点顺序,对PCR 产物进行纯化。将pcDNA3.1+质粒和纯化的PCR 产物进行XbaI 和BamHI 双酶切,切胶回收相应DNA 片段,并进行连接,转化,通过PCR 扩增方法检测阳性克隆,并进行测序验证。

2.3 脂质体介导的真核细胞转染和稳定细胞株的筛选

转染前一天,以适当密度传代细胞,使细胞在转染时处于对数生长期。将0.8~1.2μg 质量良好的质粒DNA 加入50μl 无血清培养基中混匀,然后将2μl 脂质体2000(Invitrogen)也加入50μl 无血清培养基中,室温静置5min。将DNA 和质粒混合后,室温静置20min。

将混合物直接加入24 孔板的细胞中,轻轻摇晃使其混匀,于培养箱中培养24~48h。如要构建稳定表达细胞株,按照体积比1:10~1:20 的比例用新鲜完全培养基稀释转染细胞,转移至10cm 培养皿,继续培养48h。培养两天后,加入终浓度为500 μg/ml 的G418(MEL585 细胞),继续培养。约7~15d 后,光镜下可观察到有细胞克隆出现,在显微镜下挑取细胞克隆于96孔的细胞培养板内,继续培养,待细胞长至一定数量,进行扩大培养。

2.4 双荧光报告基因检测

在转染后24~48h 检测荧光素酶活性,使用威格拉斯的双报告基因系统进行检测。即首先将5x 的细胞裂解液稀释至1x,细胞用PBS 漂洗一次,24 孔板每孔加入100μl 的细胞裂解液,晃动数次使混匀,并将细胞及所有液体移至离心管中,置于冰上。漩涡震荡5~10s,然后离心15s~2min 钟,转移上清。在荧光光度计测量管中每管加入100 μl 检测液和20μl细胞裂解液,进行读数。再加入100μl stop&Glo 溶液进行第二次读启发式教学在儿科护理学教学中的应用数。

2.5 RT-PCR 及Real-time PCR

2.5.1 TRIZOl 法提取细胞总RNA

将细胞与TRIZOL 混匀。静置混合物5min,使细胞充分融解。每1mlTRIZOL 加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15s,室温下放置2~3min。2~8°C,低于12000g,离心15min。将水相移至一新管中,加入异丙醇,每1mlTRIZOL 加0.5ml 异丙醇,室温放置10min, 2~8°C,低于12000g 离心10min。此时RNA 可见于管壁或管底。去上清,加入75%乙醇洗涤。2~8°C,低于7500g 离心5min。吸去上清,并凉干RNA,将RNA 溶于适当体积的无RNase 的水中。

2.5.2 M-MLV 合成cDNA 第一链

根据promega M-MLV RT 说明书进行,在无RNase 的离心管中混合Total RNA、 oligo(dT)、 dNTP、 DEPC 水,65°C 温育5min。然后立即冰上冷却,稍离心集中液体。依次加入以下成分:5×First-Strand Buffer 、DTT、RNase inhibitor,将溶液混匀,稍离心集中液体,37°C 温育 5min。加入1.0μl M-MLV (200U/μl)。混匀后37°C 反应60min。

2.5.3 Real-time PCR

实时荧光定量PCR 试剂盒 (SYBR? Premix Ex TaqTM) 购自Takara 公司。以GAPDH为相对定量的内参,每个样品有3 个重复孔,总体积20μl,反应体系如下:2×SYBRmix 10μl、ROXⅡ 0.4μl、4μM Primer1 1μl、4μM Primer2 1μl、cDNA 1μl、DDW 6.6μl。操作SDS 软件:选择样品(反应)类型和取名,输入各个样品名称,设置引物/探针,编辑热学过程: Stage1:94 °C, 10s;Stage2:94 °C 5s,60 °C 34s,共40 个重复,保存设置。将反应管放入仪器,点击Start,整套设备开始自动运行,采集PCR 产物荧光值。反应结束后,设置溶解曲线程序:94°C 15s,60°C→94°C,缓慢升温,产生熔点曲线或称解离曲线。设定阈值,分析mRNA 的相对表达情况。

3.结果及讨论

3.1 ZF 和SH3GLB1 基因差异表达的验证

DDRT-PCR 显示ZF 基因在脐带血红细胞(CB)中的表达高于正常成人骨髓(NB)及HPFH患者骨髓(PB)红细胞(如图1A)。同样分别以3 种诱导培养获得的红细胞cDNA 为模板进行Real-time PCR 扩增,根据得到的标准曲线方程,计算得出在诱导培养的脐带血红细胞、正常成人骨髓及HPFH 患者骨髓红细胞中ZF 的表达水平,之后使用同时扩增的内参照GAPDH进行归一化,再进行比较。ZF 的表达水平如图1B 所示,结果显示其在诱导培养的脐带血红细胞内的表达水平为正常成人骨髓红细胞内的3.8 倍,另外为HPFH 患者骨髓红细胞内的8.34 倍。与DDRT-PCR 结果基本一致,说明其可能参与胎儿珠蛋白表达的活化。

DDRT-PCR 显示SH3GLB1 基因在HPFH 患者骨髓(PB)红细胞中的表达高于脐带血红细胞(CB)中的以及正常成人骨髓(NB) (如图1C)。以3 种诱导培养获得的红细胞cDNA 为模板进行real-time PCR 扩增,根据标准曲线方程,计算得出在诱导的脐带血红细胞、正常成人骨髓及HPFH 患者骨髓红细胞中SH3GLB1 的表达水平,以同时扩增的相应内参照GAPDH进行归一化后再比较。SH3GLB1 在不同来源红细胞内的表达水平如图1D 所示,结果显示其在诱导的HPFH 患者骨髓红细胞内的表达水平为人脐带血红细胞内的2 倍,为正常成人骨髓红细胞内的1.6 倍。与DDRT-PCR 结果基本一致,说明其可能与HPFH 患者骨髓红细胞中胎儿珠蛋白高相关。

3.2 ZF 和SH3GLB1 真核表达载体构建及亚细胞定位

分别使用构建好的含ZF和SH3GLB1的pEGFP-N1 载体,转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,表达ZF 和SH3GLB1 与EGFP 的融合蛋白。转染48h 后置荧光显微镜下观察,ZF 和SH3GLB1基因产物均定位于细胞核内,而对照pEGFP-N1 质粒在所转染NIH3T3 细胞内在胞核与胞质中均有分布。这些提示这两个基因可能在细胞核中行使功能,可能参与DNA 复制及转录调节。

3.3 ZF 和SH3GLB1 对人γ-珠蛋白基因启动子的调节作用

为了实验这两个基因对于人γ-珠蛋白基因的调节作用,我们用人γ-珠蛋白启动子启动的萤火虫荧光素酶载体(γLuci)与这两个基因的真核表达质粒共转染K562 细胞。以海肾荧光素酶作为内参,双报告基因检测系统检测萤火虫荧光素酶的相对活性。结果如图3 所示,ZF+γLuci 组荧光素酶的相对活性较对照组γLuci 以及γLuci+pc3.1 有明显升高,提高大约1倍,而SH3GBL1+γLuci 组荧光素酶的相对活性较对照组γLuci 以及γLuci+pc3.1 无明显改变。

初步说明ZF 对于人γ-珠蛋白基因启动子具有一定的促进作用。其对K562 细胞内源的γ-珠蛋白基因的促进作用还需进一步证明。

3.4 ZF 和SH3GLB1 MEL585 稳定表达株的建立与鉴定

为了进一步实验这两个基因对于β-珠蛋白基因的调节作用,我们用构建得到的以pcDNA3.1 为载体并分别插入了ZF 和SH3GLB1 基因的重组表达质粒转染小鼠红白血病细胞系MEL585,经G418 筛选得到了稳定过表达ZF 和SH3GLB1 的细胞株。RT-PCR 检测了两个基因的过表达情况,结果在MEL/ZF 细胞株中ZF mRNA 水平较高,而在作为阴性对照的MEL585 转染空载体的细胞MEL/pc3.1 内未检测到ZF 表达。在MEL/SH3GLB1细胞株中检测到SH3GLB1 mRNA较高水平表达,在阴性对照MEL/pc3.1 细胞内低水平表达,说明小鼠细胞内存在与其同源的基因序列。以上结果均显示两个基因在各自的稳定细胞株中过表达成功,可用于下一步的功能分析。

3.5 ZF 和SH3GLB1 过表达对于小鼠珠蛋白基因的调节作用

用DMSO 诱导ZF 和SH3GLB1 MEL585 稳定表达细胞株向红系分化后,检测小鼠β-珠蛋白以及α-珠蛋白基因的表达。结果说明ZF 基因过量表达使得小鼠β-珠蛋白基因的表达明显下调,仅为转入空载体的阴性对照内的表达水平的50%,而SH3GLB1 基因的过量表达则使小鼠β-珠蛋白基因的表达明显升高,约为对照组的3 倍。而这两个基因过量表达对于小鼠α-珠蛋白基因的表达水平影响均不明显,说明了ZF 和SH3GLB1 对于小鼠β-珠蛋白基因表达的影响具有一定特异性。

SH3GLB1 过表达细胞株内β-珠蛋白基因表达较对照细胞有明显提高,而α-珠蛋白基因表达水平无明显区别。ZF 过表达细胞株内β-珠蛋白基因表达较对照细胞有明显降低,α-珠蛋白基因表达水平无明显区别。

4. 结论

本文鉴别了两个在人脐带血、正常成人骨髓和异细胞型HPFH 患者骨髓中差异表达的基因,ZF 和SH3GLB1。在K562 细胞中瞬时共转染γ-珠蛋白启动子报告基因载体以及这两个基因的表达载体,初步确定了ZF 对于人γ-珠蛋白启动子的促进作用。通过在MEL585 中过表达这两个基因,初步确定ZF 和SH3GLB1 对于小鼠β-珠蛋白基因的表达分别具有抑制作用和促进作用。这些为珠蛋白基因表达调控及开关机制的揭示提供了新的线索,但是对于这两个基因在珠蛋白基因转录调控和发育开关中的作用和机制尚待进一步研究确定。

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